最小抑菌浓度（MIC）的测定方法

稀释法用于测定最小抑菌浓度（MIC），该方法是评估抗菌剂对微生物生长抑制能力的重要实验技术。主要包括微量稀释法和营养肉汤稀释法。琼脂稀释法在操作简便、成本低廉和高通量筛选方面具有明显优势，非常适合自动化操作和精确调整药物浓度。而肉汤稀释法则直观易行，适合实验室规模测试，且能够根据实际需求灵活调整药物浓度和培养基体积。

琼脂稀释法

本实验利用琼脂稀释法，将不同浓度的抑菌剂溶解于琼脂培养基中，然后进行细菌点种，通过观察细菌的生长情况，确定最低抑菌浓度（MIC）。此方法特别适用于不溶性抗菌产品。

操作步骤

1. 抗菌溶液的配制：在无菌条件下，取5ml或5g样品（经固体研磨），溶解于45ml的灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡，制得10%的均匀悬液。
2. 含抗菌剂培养基的配制：将10%的抗菌溶液用PBS系列稀释，制得不同浓度的受试液，置于45℃～50℃水浴中恒温保存。
3. 双倍浓度MH琼脂培养基的制备：称取76g的MH琼脂培养基，溶于1000ml水中，加热至沸腾后121℃灭菌15分钟，保持在45℃～50℃水浴备用。
4. 含抗菌液的培养基配制：取10ml抗菌液加入平板中，再加入同量的双倍MH琼脂，摇晃混匀，待其凝固后备用。
5. 接种：用加样器取1μl～2μl的菌悬液（约107cfu/ml）点种于含抗菌液的平板中。
6. 设置阳性对照：同样方法接种不含抗菌成分的MH琼脂平板。
7. 培养与观察：将平板放入35℃培养箱中倒置培养18h～24h，观察结果。

评判标准

若菌落生长完全受抑制，则该样品对应的最低抗菌液浓度即为MIC，单一菌落的生长可忽略不计。

营养肉汤稀释法

本方法将不同浓度的抑菌剂溶解于营养肉汤培养基中，通过细菌的生长与否确定MIC，此方法适用于可溶性抑菌产品。

操作步骤

1. 根据标准方法制备金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的悬液。
2. 含抗菌剂培养基的制备：用蒸馏水稀释抗菌液，取各稀释度受试液25ml加入到含有25ml双倍浓度营养肉汤的试管中。
3. 接种：用0.1ml约108cfu/ml的菌悬液接种至抗菌的营养肉汤试管中，作为实验组样本。
4. 阳性对照：同样方法接种不含抗菌剂的营养肉汤试管。
5. 阴性对照：准备两支仅含营养肉汤的试管。
6. 培养：将样本放置于37℃培养箱中，培育48小时，观察结果。

评判标准

当阳性对照试管中出现细菌生长（混浊），而阴性对照试管保持无菌生长（透明）时，若试验组达到浓度为5×10⁵cfu/ml～5×10⁶cfu/ml的情况下无菌生长，则这一最高稀释度所对应的抗菌剂浓度即为该样品的MIC。