### 培养条件

在细胞培养中，使用的气相环境为95%空气和5%二氧化碳，培养温度维持在37℃。所用培养基为DMEM，添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素/链霉素（P/S）。A-673细胞系来源于一名15岁女性患者的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂上形成克隆，并在使用免疫抑制血清处理的小鼠中成功成瘤。这种细胞系表现出四条以上的标志染色体，具有一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。

### 传代方法

建议在进行细胞传代时，采用1:2的比例进行细胞分瓶。每次传代后的液体更换建议每两天进行，确保细胞保持在良好的生长状态。为了有效运输细胞，建议在收到细胞后立即将其处理至良好状态，然后用完全培养基灌满细胞瓶并密封。

收到细胞后，使用75%的酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后将其放置于超净台下进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，接着进行后续处理。在显微镜下观察细胞的生长情况，并按不同倍数拍照（建议分别拍摄40x、100x和200x），前三天的照片将作为重要的售后依据。如未提供照片，将默认收到状态良好。

### 细胞培养步骤

在细胞传代方面，如果细胞的汇合度未超过80%，则可以将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，留存5ml以便放入37℃、5% CO2孵箱继续培养。如果细胞密度超过80%，则可以进行传代。具体步骤包括：

1. 弃去培养上清，用不含钙和镁的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加大约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃的培养箱中消化1-2分钟。观察细胞在显微镜下的消化情况，如细胞大多数变圆并脱落，迅速返回操作台，轻敲培养瓶，加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其彻底脱落，然后移取悬液至15ml离心管中，在1000RPM的条件下离心5分钟，弃去上清后，补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代，补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

### 悬浮细胞传代步骤

对于悬浮细胞，推荐以下传代步骤：

1. 采用半换液法，竖着放置培养瓶于培养箱中静置约1小时，轻轻吸除约3ml培基，再补充3ml的新完全培养基。如果培养基颜色变化缓慢，可直接添加约500ul的FBS。在传代时可直接补充5ml的培养基并分至两个新的培养瓶中。通常情况下，经过3次这样的传代后可进行离心传代，去除死细胞。
2. 采用离心换液法时，可将细胞悬液收集至离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清，然后补加1-2ml培养液重悬，确保混匀后按1:2的比例分至新的T25瓶中，添加6-8ml根据说明书配置的新完全培养基，以保持细胞活力，后续传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存与复苏

细胞生长至覆盖培养瓶80%时，应进行冻存。步骤包括：

1. 弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞回缩变圆后，立即添加5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，然后转移至15ml离心管中，在1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml无血清冻存液（如尊龙凯时品牌），混匀后转移至冻存管中。
4. 冻存细胞应直接放入-80℃冰箱中，如需转入液氮罐，需在-80℃存放24小时以上。

解冻细胞时，应从液氮中取出细胞冻存管，快速置于37℃水浴中解冻，直至没有结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清后，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2培养箱中培养。第二天，换用新鲜的完全培养基持续培养。

### 注意事项

在运输过程中，一些细胞可能会因为贴壁不牢固而脱落，这种现象是正常的。如细胞脱落较多，可将培养液收集至离心管，进行离心以去除死细胞后，再加入胰酶进行重悬和消化处理。最终，按1:2比例分瓶传代并补充新的完全培养基，确保细胞在37℃、5% CO2的培养箱中继续生长。