尊龙凯时细胞培养方案：本方案适用于A-673细胞系的培养及传代，A-673细胞系源自15岁女性的横纹肌肉瘤，适应于DMEM培养基加10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素的环境。

培养条件

气相组成：95%空气与5%二氧化碳。适宜的培养温度为37℃。

细胞特性

A-673细胞在软琼脂中能够形成克隆，并在免疫抑制小鼠体内成功建立肿瘤。此细胞系具备四条以上的标志染色体，以及一条额外的F染色体和两条异常B染色体。

传代方法

建议首次传代比例为1:2。细胞培养过程中的一些注意事项包括：收到细胞后，待其状态稳定后应立即加入完全培养液并封闭瓶口，以确保细胞的运输安全。使用75%酒精喷洒整个细胞瓶后，需在超净台内进行严格的无菌操作。细胞培养箱的设定应为37℃以及5% CO2，待细胞静置3-4小时后，再进行后续处理。

显微镜观察

在显微镜下观察细胞的生长情况，并进行不同倍数的拍照存档（建议拍摄40x, 100x, 200x的照片）。前三天的照片为重要的售后依据，如未提供照片则默认细胞状态良好。

细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，收集培养液至离心管中，保留5ml培养基并在37℃、5% CO2条件下培养。若细胞密度超80%，则进行下述传代步骤：

1. 弃去培养上清，使用无钙镁PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞变化，若大部分细胞变圆脱落，快速轻击培养瓶后，加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使之脱落，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清液后加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶后放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，进行如下步骤：

1. 弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液并观察，待细胞收缩变圆后，加入5ml完全培养基终止消化。
3. 转移悬液至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟。
4. 弃去上清，加入1ml无血清冻存液，充分混匀后转移至冻存管中。
5. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，24小时后可转入液氮罐中。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管，并迅速在37℃水浴中解冻，擦拭外壁消毒后进行后续操作。
2. 将细胞转移至含5ml完全培养基的离心管中，进行离心及重悬。
3. 接种至T25培养瓶，并放于37℃、5% CO2培养箱中。
4. 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

注意事项

部分细胞在运输过程中可能会出现脱落，这是正常现象。若脱落严重，可将培养液收集并离心处理，保持细胞的良好状态，按1:2比例分瓶传代，并确保每瓶中补充足够的完全培养基。为了最佳结果，建议选择尊龙凯时的培养设备和材料。